제 5 장. 효소공학 (Enzyme Technology)

5.1. 효소공학 (Enzyme Technology)
1. 효소(enzyme)의 정의
    - 생물체에 존재하는 복잡한 단백질로서 생체에서 촉매작용을 수행
    - 생명체 내의 거의 모든 화학반응을 효소가 촉매작용
    참고) 모든 촉매는 반응 후 재생됨 → 적은 양으로도 많은 양의 기질과 반응
    - 효소는 다른 물리 화학적 촉매와는 달리 매우 특이적으로 반응
2. 효소의 촉매 능력은 상당히 크다: 반응속도 적어도 10⁶배 증가
    - 효소 없이는 in vivo 반응 안 일어남 (인지 불가) → 생명현상이 나타나지 않음
3. 그러나 효소는 in vitro에서도 원래의 특징적인 반응을 수행할 수 있음
    - 즉, 효소는 생체 내에서만 만들어지지만, 분리하여 생체 밖에서도 사용 가능
    - 효소공학의 대전제이자 기반
4. 효소의 활성은 효소의 1차원적 구조뿐만 아니라 3차원적 구조에서 온다
    - 많은 효소의 특이성이 효소의 3차원적 구조에 기인함
    → 효소의 3차구조를 파괴하면(pH, T, ion) 그 효소의 특징적인 성질도 없어짐
    - 수천 개의 효소가 특징 지워졌고, 상당히 많은 수가 결정(結晶)화되었음
5. 많은 종류의 효소가 단백질(apoprotein)외에도 cofactor(prosthetic group)가 존재
    - 대부분의 효소는 0-110^oC의 낮은 온도(T)와 pH 2-14의 범위에서 반응
    참고) 그러나 각각의 효소가 최적의 활성을 보이는 온도와 pH는 매우 좁은 영역
6. 효소의 상업적 이용의 장점
    - 양질의 생산물(high quality product), 적은 부산물(fewer by-product)
    - 분리정제가 용이(simpler purification procedure)
    - 환경친화적(non-toxic and biodegradable → green technology)
    - 반응조건이 온화하고, 화공약품에 내성을 가진 장치도 필요 없음
    - 미생물에 의한 대량생산이 가능 (69쪽 표 5.1)
7. 효소공학의 전망
    - 생산, 분리, 정제 등의 모든 공정이 용이해짐
    - 더구나 수용액 상태와 고정화된 효소를 이용하여 많은 생물반응기에 사용 가능
    - 당면과제인 식량/energy/환경 등의 문제의 해결에 많은 영향을 미칠 것
    - 효소공학의 발전은 생화학을 비롯한 미생물학/화학/공정공학 등의 발달에 의존
    - 효소공학과 유전공학은 서로 밀접한 관계(유전자와 그 생산물)를 유지하며 발달

5.2. 효소의 이용 (The Application of Enzymes)
1. 효소에 대한 개념은 없었으나, 발효공정은 매우 오랜 역사를 가짐
    - 술을 만든 역사는 기원전 6000년전, 맥주는 4000 B.C., cheese는 700 B.C.
    - 이러한 공정들은 나름대로 확고히 정립된 것들
2. 효소의 이용에 대한 동서양의 차이
    - 서양에서는 제빵/양조 산업의 발달로 효모(yeast)와 맥아(malt)를 중심으로 이해
        → 효모를 이용한 발효, 전분(starch)을 당(sugar)으로 전환하는 공정 등
    - 동양에서는 주로 filamentous fungi(진균류)를 이용한 식품의 발효가 중심
3. 1896년에 처음으로 현대 미생물 효소공학이 공식적으로 시작됨
    - 진균류에서 분리한 가수분해 효소인 takadiastase가 처음으로 서양에서 시판됨
    - 동양에서 오랫동안 생산되던 방법과 비슷하나 중요한 것은 동서양간의 기술 전달
4. 1897년 Buchner에 의하여 효모의 발효효소인 의하여 zymase 발견
5. 유럽에서는 가죽이 매우 중요한 물품
    - 생가죽으로 구두를 만들기 전에 bating이라는 과정으로 가죽을 연하게 함
    - bating은 오랫동안 개나 비둘기똥을 이용하여 수행됨
    - 1900년도초에 독일 화학자 Otto Röhm이 protease가 작용성분이라 밝힘
        → 1905년엔 동물의 배설물 대신, 돼지나 소의 췌장에서 비슷한 효소를 발견
6. 1950년에 들어서 미생물 효소 공학은 급격한 발전
    - 2차 세계대전중 penicillin 생산공정이 급속히 발전 → 미생물의 대량배양
    - 효소를 공업용 촉매로 쓸 수 있음이 확인되고, 효소에 대한 기본적인 지식이 증가
    - 대부분의 효소가 미생물에 의하여 생산될 수 있음
7. 이러한 현대 미생물 효소 공학의 발달로 재래공정의 개선과 새로운 공정의 시작
    → crude enzyme이 아닌 purified enzyme(cell-free enzyme)의 사용
    - crude enzyme(1%정도의 효소 함유)은 대개 수$/kg
    - purified enzyme(거의 100% 순수한 효소)은 수백$/g (10⁵배 정도의 가격)
    - 효소의 분리정제가 용이한 세포외(extracellular) 효소가 많이 사용됨
8. 재래의 crude enzyme 사용의 단점/한계
    - 많은 양의 기질(탄소원 등)이 원하는 산물이 아닌 생물량(biomass)으로 전환됨
    - 원하지 않는 여러 가지 부반응(side-reaction)이 일어남
    - 세포 활성을 유지시키는 조건이 효소에 의한 원하는 반응의 조건과 다를 수 있음
    - 원하는 산물을 분리/정제시키는 작업이 매우 어려울 수 있음
    → 이런 단점 및 한계는 정제된 효소를 이용하여 상당부분 개선될 수 있다
9. 정제된 효소의 공업적, 의약학적, 실험실적 사용은 점차 증가하는 추세
    - 가격이 문제 (최종 상품의 가격 중 효소가격의 비중)
10. 공업적으로 사용되는 대부분의 효소는 세포외 효소(extracellular enzyme)
    - protease, amylase, cellulase, lipase 등 co-factor 없는 가수분해효소(hydrolase)가 주종
    - 세포내 효소(intracellular enzyme)에 비해 분리/정제가 용이 → 먼저 상업화
11. 세포내 효소(intracellular enzyme)도 점차 공업적 사용이 증가하고 있다
    - glucose oxidase (food preservation), asparaginas (cancer therapy)
    - penicillin acylase (bioconversion or biotransformation): making new antibiotics
    - extracellula enzyme보다 훨씬 종류가 많으므로 더욱 발전할 것이 예상됨
12. 효소의 상업적 이용은 세제에의 사용과 가장 밀접한 관계 (75쪽, 그림 5.1)
    - 1965년 전까지의 효소의 생산은 매우 미미한 수준
    - 1966년부터 세제에 효소의 사용이 시작되며 급격한 증가를 보이다가
    - 1969년에 효소생산공장 근로자들에게 allergy반응이 보고되며 사용이 중단
    - 1980년대에 allergy반응을 줄이는 방법과 encapsulation의 도입되며 다시 증가 추세
    - 세제에 사용되는 효소: protease > amylase (starch) > lipase (fat) > cellulase
    - α-amylase와 amyloglucosidase는 dextrose제조에 사용되던 산의 이용을 완전히 대체
13. crude, bulk 효소의 가격은 꾸준히 하락
    - 그러나 전문화되고 특이적인 효소는 작은 양이지만 비싼 가격에 거래
14. 세계의 효소 시장은 크게 3분야 (전체 시장의 규모는 7억불 정도)
    - starch conversion (전분의 轉化): 전체 시장의 40%
    - 세제 (detergents): 30%
    - 낙농업 (dairy product): 10% 정도, 특히 cheese 제조에 쓰이는 rennet
    - rennet은 점차 동물유래보다 미생물유래나 유전자 조작에 의한 것이 많이 쓰임
    ← 재조합 DNA기술 등의 발달이 유전공학/생물공학적 방법에 의한 생산원가를 줄임
    → 그러나 computer의 microchip처럼 극히 작은 양만 사용됨
15. 따라서 효소 시장은 앞으로 양극화될 전망: 값싼 bulk 효소와 매우 비싼 고순도 효소
    - 1000 kg의 기질을 반응시키는 데 필요한 1-2 kg의 bulk enzyme ($3-25/kg)
        → 대량생산되는 공업용 효소 (high volume, industrial grade enzymes)
    - 진단시약등으로 사용되는 수 μg ~ 수 mg의 고순도의 효소 ($100,000/kg)
        → 소량의 고순도 분석/진단/치료용 효소 (low volume, high purity enzymes)
        - 이런 효소들은 유럽국가들이 거의 장악 (77쪽, 표 5.3)
16. 목재(lignocellulose)를 분해할 수 있는 효소의 등장이 효소공학의 기폭제가 될 것
    - 현재 많은 연구가 진행되고 있으며
    - 지구상에 가장 풍부한 물질인 cellulose를 이용하면 많은 당면과제가 해결될 것

5.3. 효소의 유전공학과 단백질공학 (Genetic and protein engineering of enzymes)
1. 재조합 DNA 기술은 원하는 유전자를 다른 생물로 옮기는 것이 가능하게 함
    - 상업성이 있는 효소가 발견되면, 그 유전자를 미생물로 옮김 (78쪽, 그림 5.2)
    → 생산하기 쉽고, 고순도로 분리/정제가 용이
2. 이런 유전공학의 예는 Novo Nordisk A/S의 Lipolase (세제에 쓰이는 지질분해 효소)
    - fungus(진균류)인 Humicola languinosa에서 발견되었으나 상업적 생산에 부적합
    - 유전자를 생산이 용이한 다른 fungus인 Aspergillus oryzae로 옮겨 상업화
    - 광범위한 온도와 pH에서 매우 안정하며, 세제에 쓰이는 protease에 내성이 있음
3. 단백질공학(protein engineering)은 분자적 수술이라 할 만큼, 효소의 활성을 변화시킴
    - 79쪽, 표 5.4에 나타난 바와 같이 다양한 목적을 얻을 수 있다
    - 활성/안정성의 증가
    - 최적 활성 온도/pH 등 조건의 변화에의 적응
    - 다른 기질 또는 유사반응에의 응용
    - 공정의 전체적인 효율을 높이기 위하여
4. 효소의 활성을 바꾸는 2가지 방법
    - site-directional mutagenesis: 재조합된 유전자의 특정부분을 원하는 것으로 바꿈
        → 바뀌어진 유전자가 다른 amino산을 coding하여 다른 단백질 만듦
    - chemical mutation: 화학적/효소적인 반응으로 효소를 변형시킴
        → 예) phospholipase A: 산에 강하도록 바꿈
5. 유전공학과 단백질공학은 효소공학산업의 여러면에 많은 도움을 줄 것이며,
    - 경제성, 생산성을 향상시킬 뿐만 아니라, 환경친화적인 효소로의 변형도 가능

5.4. 효소의 생산기술 (Technology of Enzyme Production)
1. 동식물에서도 많은 효소가 발견되기는 하였으나, 대부분의 효소는 미생물유래
    - 미생물유래의 효소가 대개 더 특이적이며 단위질량당 활성이 높다
    - 계절, 날씨, 또는 정치 등에 비교적 영향 받지않고, 꾸준한 생산이 가능
    - 많은 종의 미생물이 존재하므로, 온도, pH 등의 특성에 맞춰 고를 수 있다
    - 균주의 선택, 돌연변이, 생산의 유도, 생장의 최적화, 유전자 조작이 가능하다
    → 특이한 환경에서 자라는 미생물의 유전자도 흔한 미생물로 옮겨 생산할 수 있음
2. 균주의 선택은 단지 목적산물을 가장 많이 생산하는 것을 고르는 것은 아님
    - 원하는 환경에서 잘 작용하는 지
    - 키우는 데 비싼 재료가 들어가지 않는 지
    - 목적 산물이 분비(secretion)되는 지
    - 다른 유해한 물질(다른 효소나 pyrogen 등)이 생산되지 않는 지
    - 기타 바람직한 특성 (예: 세제용 protease는 열과 높은 pH에 안정한 B. subtilis유래)
        높은 수율 및 안정성, 가능하면 유도인자가 필요없는 발현체계, 정제의 용이성
    - 이런 과정에서 원하지 않는 성질은 제거/변형할 수도 있다
        원하는 산물 이외의 대사물(유해물질 포함), 냄새, 색
3. 현재 상업적으로 많이 쓰이는 균주들의 유전학적인 연구는 미미한 편
    - 그러나 현대의 유전공학과 단백질공학이 발달하며, 새로운 차원으로 들어섬
4. 현재 많은 효소의 생산공정이
    - 값싸고 영양이 풍부하며, 안정적으로 다량을 확보할 수 있는 기질을 사용
        → starch hydrolysate(가수분해물), 옥수수 syrup, 당밀(molasses), 그밖의 곡물 등
    - 부유배양(submerged liquid culture)이나 고체배양(solid state fermentation)
        → 특히 고체배지의 사용은 매우 오랜 역사를 가짐 (한국, 일본, 중동권 등)
        → 미생물 효소의 성격상 생물반응기를 사용하므로 액체배지를 이용 (그림 5.3)
    - 액체배지를 이용하는 경우, 대개 10-50 ton규모의 생물반응기에서 30-150시간 배양
        → 원하는 미생물만이 배양될 수 있도록 멸균 및 무균상태 유지가 중요함
    - 어떤 배지를 사용하든지, 필요에 따라 효소를 정제하여야 한다 (83쪽, 그림 5.5)
        → 효소의 최종가격에 상당한 영향을 주는 부분
5. 생산된 효소의 사용처에 따라 적당한 독성(toxicity)검사가 필요 (84쪽, 표 5.5)
    - GRAS(generally regarded as safe) microorganism의 사용의 잇점
    - 특히 식품에 사용될 경우, 유해한 생물이나 독성물질이 없도록 하는 것이 중요

5.5. Immobilized Enzymes (효소의 고정화)
1. 효소를 액상이나 고체분말로 사용하면, 회수가 어려워 낭비의 여지가 많다
    → 효소를 막/입자 등 불용성 고분자 물질등에 고정화시켜 회수를 용이하게 함
    - 이런 고분자 물질을 효소의 활성의 지지체(support)나 담체(carrier)라 한다
2. 일반적인 고정화 방법 (85쪽, 그림 5.6)

결합 (bonding)	물리적 결합 (carrier없이 cell끼리의 결합)	응집 (flocculation)
		흡착 (adsorption to surface carriers)
	화학적 결합 (carrier없이 효소끼리 결합)	carrier와의 결합 (carrier의 표면)
		효소끼리의 결합 (cross-linking)
포획 (entrapment)	gelation (주로 세포의 고정화에 많이 사용)
	encapsulation (주로 효소의 고정화에 많이 사용)

3. 효소의 고정화 방법의 장단점 (86쪽, 표 5.6)

방법	장점	단점
공유결합에 의한 부착	pH, ion strength 등에 무관	효소의 활성부위가 변형될 수 있음, 비싼 공정
공유결합에 의한 교차결합	강한 결합 → 효소의 탈착이 거의 없음	효소의 활성 감소 가능, carrier의 재생이 불가능
흡착 (adsorption)	가장 싸고 간단, carrier의 재생이 용이, 효소의 변형 없음	ionic strength의 변화에 의한 탈착 가능, 다른 효소에 의한 변형 가능
포획 (entrapment)	효소의 화학적 변형 없음	기질의 확산이 문제, 효소가 큰 pore로 연속적으로 샐 수 있음

4. 고정화된 효소의 장점 (87쪽, 표 8.7)
    - 효소의 회수가 용이하여 짐에 따라 효소의 재사용이 가능
    - 효소의 재순환에 의한 연속식 반응에 이상적임
    - 생산되는 물질이 효소가 전혀없는 상태
    - 효소의 농도의 조절이 용이하며, 정확함
    - 효소의 안정성이 증가됨
    - 여러 가지의 효소를 동시에 사용하는 multi-enzyme 반응이 가능
    - 상업적, 의약학적 이용에 무궁무진한 잠재력이 지님
    - 폐수의 발생을 줄일 수 있다
5. 고정화된 효소나 세포를 이용한 생물반응기 (88쪽, 그림 5.7)
    - 회분식 생물반응기: 회분식으로 배양, 배양 후 세포나 효소를 재순환
    - 연속식 생물반응기: 연속적인 기질의 공급, 생산물의 제거
    - 연속식 고정층 반응기 (continuous packed-bed reactor): 일정 부피에 고정화된 bead
    - 연속식 유동층 반응기 (continuous fluidized-bed reactor): 고정화된 bead가 혼합됨
6. 고정화 효소 반응기의 이용
    - immobilized penicillin acylase: penicillin G,V → 6-amino penicillanic acid (6-APA)
    - immobilized glucoisomerase: high fructose corn syrups → isomerization of glucose
    - immobilized aminoacylase: production of amino acid (Met, Phe, Trp, Val)
7. enzyme electrodes (91쪽, 그림 5.10)
    - biosensor designed for the potentiometric or amperometric assay of substrate
        → assay for urea, amino acid, glucose, alcohol and lactic acid
    - biological component: (multi-)enzyme system, Ab, organelle, microbial cell, etc.